طی واکنش‌های آنتی ژن-آنتی بادی در الایزا، سیگنال‌هایی تولید ‌می‌شود که بصورت رنگ قابل مشاهده و با استفاده از دستگاه الایزا ریدر قابل اندازه گیری هستند. بنابراین زمانی که این واکنش‌ها کمتر از حد انتظار صورت پذیرد، سیگنالی دیده نشده و موجب جذب نوری پایین خواهد شد.

• در زمان تست مواد داخل کیت به دمای اتاق رسانده نشده‌اند:

مطمئن شوید که تمامی اجزای کیت به دمای اتاق رسیده‌اند (20 تا 25 درجه سانتی گراد).

• مقدار نمونه برداری پائین (کمتر از مقدار لازم ) است:

الف) مطمئن شوید که نوک سمپلرها خوب و محکم فیت شده‌اند.

ب) لوله سمپلرها را چک کنید تا گرفته نشده باشند.

ج) کالیبراسیون سمپلرها را چک کنید و در صورت عدم کالیبره بودن آنها باید کالیبره شوند.

• محلول کروموژن – سوبسترا به درستی تهیه نشده است:

الف)  محلول کروموژن – سوبسترا را درست قبل ار استفاده آماده کنید.

ب) طرز تهیه محلول کروموژن – سوبسترا را در پروتوکول کیت با دقت مطالعه کرده و به آن عمل کنید.

• آلودگی سوبسترا به اسید و یا آلودگی کنترل مثبت به باکتری:

مجدداً تست را با اجزاء یک کیت تکرار کنید.

• زمان انکوباسیون خیلی کوتاه است:

الف)  کالیبراسیون تایمر را چک کنید.

ب) تایم انکوباسیون را ثبت کنید.

• ورود رطوبت به کیسه حاوی پلیت:

الف)  عملکرد صحیح نم گیر داخل کیسه پلیت را بررسی کنید

ب) استریپ‌هایی که مصرف نمی‌شوند را در کیسه پلیت قرارداده و در آن را محکم ببندید

ج) زمان باز کردن درب کیسه پلیت را در بار اول بر روی کیسه پلیت ثبت کنید

• دمای ناصحیح در مدت انکوباسیون:

دمای انکوباتور و یا اتاق (20 تا 25 درجه سانتی گراد) را بررسی کنید.

• شدت شستشو زیاد است:

شدت فشار شستشو در سیستم شستشو را کاهش دهید.

• مواد کیت قبل از استفاده خوب مخلوط نشده‌اند:

مواد را قبل از استفاده خوب مخلوط کنید.

• در خلال انجام تست چاهک‌ها خشک شوند:

تمام مراحل انجام تست را بدون وقفه انجام دهید.

• ضعف یا خرابی محلول متوقف کننده واکنش:

افزودن محلول متوقف کننده واکنش سالم شدت رنگ را افزایش داده و باعث تثبیت رنگ می‌شود.

• افزودن ناکافی آنزیم کنژوگه غلیظ به محلول رقیق کننده برای ایجاد محلول آماده کار:

کنژوگه را دوباره با صحت کامل تهیه کنید به طرز تهیه صحیح در پروتوکول کیت مراجعه کنید.

گاهی در نتایج الایزا با شدت زیادِ رنگ در چاهک‌ها مواجه می‌شویم که به دلیل اتصالاتِ غیر اختصاصی در واکنش‌های آنزیمی صورت می‌گیرد، به این پدیده High Background می‌گوییم.

• غلظت زیاد کنژوگه آنزیمی و عدم تهیه طبق دستورالعمل کیت
• قرار گرفتن سوبسترا در معرض نور، قبل از مصرف
• ایجاد آلودگی آنزیمی در نمونه‌های سرمی، توسط پیپت و سرسمپلر آلوده با سوبسترا و یا کونژوگه آنزیمی
• آلودگی متقاطع با دیگر نمونه‌ها و یا با کنترل مثبت
• آلودگی سوبسترا با یون‌های فلزی و یا عوامل اکسیدکننده
• درجه حرارت بالا در مرحله انکوباسیون و تبخیر چاهک‌ها
• استفاده از انکوباتور خشک به جای مرطوب (طبق دستورالعمل کیت عمل شود)
• شستشوی ناکافی و یا محلول شستشوی رقیق
• عدم توقف واکنش و عملکرد معیوب محلول متوقف کننده
• عملکرد اشتباه دستگاه الایزا ریدر (دستگاه بصورت دوره‌ای چک شود)
• استفاده از فیلتر نادرست برای خوانش جذب نوری (از فیلتر رفرانس استفاده شود)

• آلوده شدن چاهک‌های کنترل منفی با کنترل مثبت:

در هنگام عملیات شستشو از سر ریز شدن محلول شستشو از چاهک‌های پلیت به یکدیگر اجتناب کنید.

• آلوده شدن ویال کنترل منفی در هنگام شستشو:

الف)  برای هر نمونه برداری از نوک سمپلر جدید استفاده کنید.

ب)  همیشه ابتدا کنترل منفی را در چاهک‌ها ریخته و بعد کنترل مثبت را بریزید.

ج) پیپت و یا لوله‌های سمپلر و نوک سمپلرها را چک کنید و در صورت وجود قطرات باقی مانده از قبل و یا مواد خشک شده در آنها باید تعویض شوند.

د) توجه داشته باشید که نوک سمپلر به اندازه کافی بلند باشد تا نمونه‌ها با انتهای لوله سمپلر تماس پیدا نکند.

• شستشوی ناکافی و یا آلوده شدن کنترل منفی با آنزیم کنژوگه:

الف) در هنگام شستشو مطمئن شوید که تمامی باقیمانده‌های آنزیم کنژوگه از چاهک‌ها خارج شده‌اند.

ب) تمامی نمونه‌ها و مواد را در مرکز کف چاهک‌ها بریزید و از تماس نوک سمپلر با دیواره و لبه چاهک‌ها بپرهیزید.

• اتصالات غیر اختصاصی آنتی بادی‌ها:

این مورد مربوط به تولید کننده کیت می‌باشد و ممکن است عملیات بلاکینگ و یا سایر پروسه‌های جلوگیری کننده از مداخله آنتی بادی‌های غیر اختصاصی خوب صورت نگرفته باشد.

• واکنش مستقیم کنژوگه با مواد کف چاهک‌ها:

این مورد نیز مربوط به تولید کننده می‌باشد و باید با تولید کننده تماس واکنش مستقیم کنژوگه با مواد کف چاهک‌ها حاصل شود.

• شستشو به خوبی انجام نشده است:

مراحل شستشو را طبق پروتکل کیت مورد استفاده انجام دهید.

• رقیق سازی محلول‌ها به خوبی انجام نشده است:

مطمئن شوید که رقت محلول‌ها طبق پروتکل کیت مصرفی انجام شود.

• خطا در پیپت کردن استاندارد‌ها وجود دارد:

پیپت‌ها را کالیبر کرده و مطمئن شوید مقدار درستی از استاندارد‌ را برمی‌دارند.

• معرف‌ها به خوبی مخلوط نشده‌اند:

قبل از استفاده از محلول‌، ویال‌ها را بخوبی بچرخانید (spin) و از حل شدن تمامی مواد مطمئن شوید.

• کیفیت پایین محلول استاندارد:

شرایط نگهداری از محلول استاندارد طبق پروتکل کیت مصرفی لحاظ شود.

• حجم غیر کافی از محلول شستشو بکار گرفته شده و سوبسترا با ذرات باقی مانده آنزیم کنژوگه در چاهک‌ها واکنش داده است:

در هنگام شستشو چاهک‌ها را تا نزدیک به انتهای پر کنید.

• استفاده از آنزیم کنژوگه خیلی قوی:

محلول رقیق شده کنژوگه و طرز تهیه کنژوگه را چک کنید.

• وجود برخی فاکتورهای سرمی در سرم حرارت دیده:

سرم را حرارت ندهید.

• محلول سوبسترا با کنژوگه آلوده شده است

الف) لوله سمپلر را برای وجود ذرات مایع یا خشک شده بازرسی کنید.

ب) نوک سمپلر به حد کافی بلند باشد که مایع با انتهای لوله سمپلر تماس پیدا نکند.

• محلول سوبسترا تازه نیست:

محلول سوبسترا را پس از انقضاء تاریخ مصرف استفاده نکنید.

• پلیت قبل از خواندن جذب نوری مدت زیادی مانده باشد:

بعد از افزودن محلول متوقف کننده واکنش حداکثر تا 30 دقیقه جذب‌ها را بخوانید.

• ظرف محتوی سوبسترا آلوده و کثیف است:

ظروف را قبل از استفاده چک کنید.

• در خلال انکوباسیون سوبسترا پلیت در مقابل نور قرار گرفته است:

پس از ریختن محلول سوبسترا پلیت را در یک محل تاریک قرار دهید.

• یکی از مراحل الایزا فراموش شده است:

دستورالعمل را به دقت مطالعه کرده و مجددا تست را تکرار نمایید.

• کنژوگه آنزیمی غیرفعال شده است:

الف) با مخلوط کردن کنژوگه و سوبسترا داخل یک لوله آزمایشگاهی و مشاهد رنگ آبی می‌توان از فعالیت کنژوگه اطمینان حاصل کرد.

ب) محلول کنژوگه را تعویض و مجددا تست را تکرار کنید.

• شرایط نگهداری کیت نامناسب بوده است:

الف) دمای محل نگهدارای کیت‌ها را چک کنید. دما باید بین 2 تا 8 درجه سانتی گراد باشد.

ب) شرایط حمل و نقل کیت با شرکت ارسال کننده چک شود.

• شستشوی چاهک‌ها به درستی انجام نشده است:

الف)  سختی آب مقطر و pH محلول بررسی گردد.

ب) در صورتی که شستشو بصورت دستگاهی انجام می‌شود، فاصله مناسب نیدل آسپیراسیون تا کف چاهک در هنگام شستشو رعایت شود.

• کونژوگه به درستی تهیه نشده است:

مجدداً طبق دستورالعمل آن را تهیه کرده و تست را تکرار نمایید.

• آنزیم کونژوگه آلوده است:

مطمئن شوید که ظروف و وسایل مورد استفاده آلوده نبوده‌اند.

• نمونه‌ها به دمای اتاق نرسیده‌اند:

قبل از انجام تست نمونه‌ها را به دمای اتاق برسانید.

• کونژوگه ضعیف است:

طرز تهیه آن را دوباره چک کنید و تست را با محلول کونژوگه دوباره آماده شده تکرار کنید.

• دمای پایین آزمایشگاه و یا دمای پایین سوبسترا:

دمای آزمایشگاه و سوبسترا را چک کنید. (دما باید بین ۲۵ تا ۲۰ درجه سانتی گراد باشد)

• نمونه‌ها به خوبی مخلوط نشده‌اند:

نمونه‌ها را به آرامی و به طور مساوی مخلوط کنید.

• خطا در پیپت کردن محلول و نمونه‌ها:

الف) پیپت‌ها را مطابق دستورالعمل کالیبر کرده و مطمئن شوید میزان درستی از مواد را بر‌می‌دارند.

ب) دستگاه دیسپنسور را چک نمائید.

• محلول‌های معرف منقضی:

تاریخ انقضای محلول معرف را بررسی کرده و تا حد امکان از محلول‌های تازه آماده شده استفاده کنید.

• اثر حاشیه‌ای یا Edge effects:

مطمئن شوید پلیت و معرف‌ها قبل از شروع آزمایش به دمای محیط رسیده‌اند.

• وجود حباب در چاهک‌ها:

از ایجاد حباب‌ در چاهک‌ها جلوگیری شود.

• خراش دادن سطح پلیت با سر سمپلر:

فاصله مناسب سر سمپلر با ته چاهک‌ها رعایت شود.

• تکنیک شستشوی نادرست:

الف) عمل شستشو را بر اساس پروتکل کیت مصرفی انجام دهید.

ب) هر چاهک را کامل با محلول شستشو پر کنید؛ مراقب باشید محلول شستشو سرریز نشود؛ پس از خالی کردن محلول شستشو، پلیت را به خوبی خشک کنید.

عملیات شستشو جهت جدا کردن ترکیبات باند شده به کف چاهک‌ها از آنهایی که متصل نشده‌اند صورت می‌گیرد. این عمل با خالی کردن مایع داخل چاهک ها و ریختن مایع شستشو به داخل آنها انجام می‌شود که معمولا حداقل باید سه بار این عمل را تکرار کرد. محلولی که جهت شستشو استفاده می‌گردد باید دارای شرایط خاصی باشد، مثلاً باید شرایط ایزوتونیکی ایجاد نماید تا بر پیوند آنتی ژن و آنتی بادی اثر سوء نداشته باشد. یکی از بهترین محلول‌ها که بیشترین استفاده را جهت شستشو در الایزا دارد محلول PBS می‌باشد (آب معمولی به علت اینکه دارای شرایط یکسان و استیبل در مشخصاتی چون PH و مولاریته و… نمی‌باشد مایع چندان خوبی جهت شستشو نیست).

گاهی در برخی از محلول‌های شستشو از برخی دترجنت ها استفاده می‌گردد (مانندTween) تا قدرت شستشوی محلول افزایش یابد. باید توجه داشت که در صورت استفاده از دترجنت‌ها در محلول شستشو باید دقت شود که این دترجنت اثر سوئی بر روی آنتی ژن‌ها نداشته باشد (مانند اثر دناتوراسیون). در ضمن در موارد استفاده از دترجنت در محلول شستشو احتمال بوجود آمدن حباب در هنگام ریختن محلول شستشو در چاهک‌ها وجود دارد که این حباب‌ها می‌توانند از تماس محلول با کف چاهک ممانعت کرده و در نتیجه عملیات شستشو را در آن نواحی مختل کنند. لذا باید از تشکیل حباب در چاهک‌ها در هنگام شستشو بشدت اجتناب ورزید.

• مراحل تهیه محلول شستشو را به دقت انجام دهید.
• صحت عمل دستگاه شستشو را روزانه و به صورت روتین چک کنید.
• از تراز بودن سطح پلیت در هنگام شستشو اطمینان حاصل کنید.
• مطمئن شوید که چاهک‌ها در هنگام شستشو کاملاً پر می‌شوند (در هنگام پر شدن چاهک‌ها سطح گنبدی مایع قابل مشاهده می‌باشد).
• از خروج باقی مانده‌های کنژوگه در هنگام شستشو اطمینان حاصل کنید.
• در هنگام شستشو از سر ریز شدن محلول شستشو و ورود آن به چاهک‌های مجاور بپرهیزید.
• در دستگاه واشر فشار شستشو را کاهش داده و از فشارهای بالا استفاده نکنید.
• در هنگام شستشو باید طبق دستور کیت به تعداد دفعاتی که ذکر شده عملیات شستشو را انجام داد.
• بین هر مرحله شستشو پس از ریختن محلول شستشو 20 ثانیه وقفه ایجاد کنید.
• در هنگام خالی کردن و یا آسپیره کردن محلول شستشو اطمینان حاصل کنید که تمامی آن خارج می‌شود.
• پس از اتمام مراحل شستشو با برگرداندن پلیت بر روی کاغذ نم گیر ذرات باقی مانده را خارج کنید.

• در شستشوی دستی پلیت مهم‌ترین نکته این است که تمام نقاط چاهک‌ها در تماس با محلول شستشو قرار گیرند و نباید هیچ گونه حباب هوائی ایجاد شود.

در این دستگاه‌ها سیکل‌های متعدد شستشو قابل برنامه ریزی است و این دستگاه‌ها باید بصورت روتین مورد معاینه قرار گیرند، تا کارکرد آنها دائماً مورد تائید واقع شود. زیرا ممکن است اشکالات خاصی که در آنها ایجاد می‌شود مانع شستشوی صحیح گردند (مانند مسدود شدن کانال‌های شستشو).

•  سمپلرها را طبق دستور سازنده آنها مرتباً کالیبره کنید.
• از تماس نوک سمپلر از دیواره یک چاهک به چاهک دیگر بپرهیزید.
• از پاشیده شدن نمونه‌ها و سایر محلول‌ها به اطراف و سایر چاهک‌ها بپرهیزید.
• از خارج کردن محلول‌های باقیمانده در نوک سمپلر با فوت کردن بپرهیزید.
• برای هر نمونه یا محلول از نوک سمپلر جدید استفاده کنید.
• لوله سمپلر را جهت وجود قطرات و یا مواد خشک شده چک کرده و در صورت وجود آنها را پاک کنید.
• از فیت و محکم شدن نوک سمپلرها بر سر سمپلر اطمینان حاصل کنید.

• تقریباً نیم ساعت قبل از شروع تست تمامی اجزای کیت را به دمای اتاق (20 تا 25 درجه سانتی گراد) برسانید.
• دمای کلیه انکوباتورها را چک و تنظیم نمائید.

* به یاد داشته باشید که دمای پایین‌تر از حد لازم می‌تواند باعث کاهش جذب نوری شده و دمای بالاتر از آن منجر به افزایش جذب نوری خواهد شد.

• تبخیر مایع در چاهک‌ها می تواند باعث اثر لبه‌ای (Edge Effect) گردد که در نتایج آزمایش اختلال ایجاد می‌کند.
• دمای مناسب برای انکوباسیون در دمای اتاق 20 تا 25 درجه سانتی گراد می‌باشد بنابراین دمای اتاق را با استفاده از ترمومتر حساس و کالیبره شده اندازه گیری کرده و تنظیم نمائید.
• دستیابی به دمای کاملاً مناسب برای هر تست از ضروریات است بنابراین:

الف) کالیبراسیون تایمرها را بررسی کنید و در صورت عدم دقت کافی آنها را تنظیم و یا تعمیر نمائید.

ب) زمان انکوباسیون‌ها را ثبت نمائید.

ج) پس از افزودن محلول متوقف کننده واکنش هر چه سریعتر جذب نوری‌ها را قرائت نمائید.

• قبل از باز کردن درب کیسه حاوی میکروپلیت آن را به دمای اتاق برسانید.
• بعد از افزودن سوبسترا پلیت را در جای تاریک قرار دهید.
• در هنگام خالی کردن پلیت باید دو طرف آن را طوری فشار دهید که استریپ‌ها نتوانند خارج شوند.
• اگر استریپ‌ها در هلدر خوب فیت نمی‌شوند، ابتدا آنها را 180 درجه چرخانده و جا بزنید و اگر باز هم فیت نشدند از هلدر مناسب استفاده کنید.
• استریپ‌های استفاده نشده را همراه با نم‌گیر به داخل کیسه مخصوص برگردانده و در آن را خوب ببندید.
• در زمان باز کردن درب پلیت در بار اول تاریخ را روی کیسه پلیت یادداشت کنید.
• اثر انگشت‌ها را توسط محلول شستشو از روی پلیت پاک کنید و آن را خشک کنید.
• توجه کنید که در هنگام انجام مراحل تست مانند شستشو، ریختن محلول‌ها در چاهک‌ها و قرائت جذب نوری، چاهک‌ها در جای خود باشند.
• قبل از قرائت جذب نوری زیر پلیت را با دستمال مخصوص بدون ذرات پخش شونده پاک کنید.
• در خلال انجام تست نباید اجازه داد که کف چاهک خشک شوند.